品牌: biomics
公司: 百奧邁科生物技術有限公司
提供商： Biomics Biotech 服務名稱： sgRNA活性檢測
產品詳情請聯系金山科研平臺微信：jinshanbio Biomics提供多種sgRNA活性檢測方法，包括SSA luciferase報告系統、Surveyor法、Q-PCR、突變點基因測序等SSA檢測：根據客戶要求檢測sgRNA的活性及敲除效率，客戶也可以選購我公司Precut pSG-target Cloning kit自行構建報告載體用于檢測，我公司提供陽性及陰性sgRNA及其SSA report target質粒。檢測原理：SSA報告質粒(pSG-target)中luciferase基因被終止密碼子提前終止，這種截短的luciferase沒有活性。為檢測sgRNA的剪切活性，將Cas9/sgRNA的靶點序列插入到終止密碼子之后。在Cas9和sgRNA的作用下，靶點位置的序列被有效剪切形成DSB，細胞通過同源重組重新形成有活性的luciferase（Figure 1），通過檢測luciferase的活性升高就可以反應Cas9/sgRNA的剪切活性（Figure 2）
Figure 2. Restore disrupted luciferase function via sgRNA-mediated homologous recombinationFigure 3.Increased FL/RL ratio in Cas9/sgRNA transfection cells.
Surveyor法及測序驗證：
CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突變的方式與ZFN、TALEN基本一致，都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的應用中，活性檢測或是突變效率的檢測可以參照ZFN和TALEN方法.主要包括有:靶位點直接PCR后TA克隆測序和基于可以識別錯配雙鏈的錯配內切酶檢測法（Surveyor法）。 Surveyor法即錯配酶法：靶序列經CAS/sgRNA切割后由于缺乏修復模板，將主要以非同源重組的方式進行修復，或多或少會插入或刪除一些堿基。因此將靶序列PCR擴增后經變性、退火，將形成錯配。錯配酶（主要是CEL1或T7E1酶）將識別錯配的雜合雙鏈并剪切。產物跑電泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。
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