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品牌: genelb 公司: 上海晶萊生物技術有限公司

提供商： 晶萊生物 服務名稱： 凝膠遷移或電泳遷移率EMSA實驗 規格： 凝膠遷移或電泳遷移率EMSA實驗

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【晶萊生物】凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測 如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異）， 和其它非相關的片段（非特異），來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據復合物的特點和強度來確定特異結合。實驗步驟1. 探針的標記探針為含有與蛋白特異結合的中心盒，大約20 bp左右，使用pierce公司的3’末端標記試劑盒(PIERCE，Rockford，IL，USA)標記。操作步驟參照說明書，具體步驟如下： 1) 將試劑盒中除TdT以外的其他組分解凍并置于冰上。迅速稀釋TdT：Sx TdT Reaction Buffer 2 u1，超純水7 ul 20 U/ul TdT 1 ul。稀釋后得到1 Xdiluted TdT(2 U/ul)，稀釋后的TdT必須現配現用，稀釋后不能保存。 2) 反應體系：5x TdT buffer 10 ul，DNA 5 pmol，Biotin-ll-UTP 5 ul，diluted TdT5 ul，超純水補足50 ul。在37℃溫浴30 min，加入2/5體積0.2 M EDTA，終止反應。加入等體積氯0仿：異戊醇(24：1)抽提TdT，渦懸充分，高速離心3 min，取上層即為標記探針，分裝后-80℃保存。2. 非變性電泳 1) 非變性電泳：30%丙稀酸胺2.66 ml，TBE(5X)2 ml，10%過硫酸按1.4 ml，TEMED7 ul，雙蒸水補足20 ml。按照上述配方配置4%的非變性膠。在燒杯中迅速混勻，置于冰上，灌膠，待凝膠聚合后拔出梳子，用雙蒸水洗點樣孔，再用0.5xTBE清洗點樣孔。 2) 樣品準備：按照不同的組合加入DNA和蛋白，另外還需要加入結合緩沖液，如果是粗蛋白還需要加入poly(dI.dC)(試劑盒中有)抑制非特異性條帶的產生。 3) 電泳：預跑膠30-60 min，100 V。上樣。跑膠，100 V，30 min左右。注意電泳要在冰上完成，以防止電泳時產生熱量使不穩定的復合物解離。 4) 轉膜：電泳跑好后，將膠取下，放在大小相似的尼龍膜上，上下各加一層潤濕的blotting paper，放到半干轉移裝置上，100 V，380 mA，轉膜1 h。 5) UV交聯：取出膜。在紫外交聯儀中999.9 mJ，固定10 min。 6) 洗膜： a. 將Blocking Buffer和4XWash Buffer置于37-50℃使其溶解。 b. 用20 ml of Blocking Buffer封閉膜，溫浴15 min，搖床輕搖。 c. 在20 ml Blocking Buffer中加入66.7 ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1：300稀釋)，配置成conjugate/blocking solution。 d. 將膜從blocking buffer中取出，在conjugate/blocking solution中輕搖15 min。 e. 將4XWash Buffer用雙蒸水稀釋成1 Xwash solution。 f. 將膜置于新的培養皿，用20 ml 1 Xwash solution沖洗。 g. 用1 Xwash solution洗膜4次，每次5 min，搖床輕搖。 h.在新培養皿中加入30 ml Substrate Equilibration Buffer，將膜放入，溫浴5 min，搖床輕搖。 i. 將6 ml Luminol/Enhancer Solution和6 ml Stable Peroxide Solution避光置于錫箔紙包好的燒杯中，搖勻，作為Substrate Working Solution。 j. 將膜從Substrate Equilibration Buffer中取出，用濾紙盡量吸去液體，放入新的培養皿。 k. 將Substrate Working Solution用槍慢慢加到膜上使液體盡量到達整張膜，靜置5min。 l. 取出膜，控制膜不能干燥。 m. 用保鮮膜將膜包好，不能有氣泡。 n. 在暗室中，將膜放入曝光盒，用X-ray膠片壓片，曝光時間隨溫度變化而不同，室溫一般1 min。然后將膠片取出，經過顯影，水洗和定影可以看到實驗結果，如果膠片長期保存一定要在水龍頭底下長時間沖洗，晾干后可拍照?？蛻籼峁?、客戶提供組織、細胞，公司提取核蛋白并進行蛋白濃度測定；2、客戶提供核蛋白，公司進行蛋白濃度測定；3、客戶提供已知濃度的核蛋白，公司進行EMSA實驗。我們將為您提供：樣品質檢報告、實驗數據分析、實驗方法及樣品EMSA電泳圖。收費標準/服務周期/提供結果：歡迎咨詢詳談，我們會根據您的方案及需求制定詳細的服務協議。更多實驗技術服務請瀏覽網站其他內容，或來電咨詢！做實驗，找晶萊！您的科研生涯，我們一路相伴！【平臺項目開展范圍】慢病毒，腺病毒，RNAi類，分子生物實驗，病理實驗，免疫學實驗，細胞實驗，動物實驗，蛋白組學實驗，芯片類實驗，并為廣大客戶朋友們提供課題設計指導、基金申請指導、SCI、核心期刊等服務。全國統一咨詢服務熱線:4008-766-085【上海公司】上海市嘉定區槎溪路788弄1號17層【北京公司】北京市大興區科創十四街嘉捷·BDA企業匯16號樓三層【長沙公司】長沙市高新區麓谷大道627號新長海中心B2-403室 【技術咨詢】18500539084【公司郵箱】lab-china@genelb.cn【全國業務咨詢】北京：18810244671 上海：15800916241 長沙：15616228964 武漢：15201856307 西安：13651049420 廣州：18810244571 其他地區：13818286017【晶萊生物】已開展了數千個實驗外包項目。我們專注于醫學課題研究，已從課題申請、方案設計、試劑采購、模型構造、標本檢測、數據分析、以及對SCI撰寫與發表的支持，各個環節積累了數千個成功案例經驗，為數千個來自臨床的科研工作者解決了大量的科研問題。更多相關實驗服務信息請咨詢晶萊生物