Fluo 3-AM試劑貨號：F023
1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester
CAS號：121714-22-5
商品信息
儲存條件：-20度保存，避光
運輸條件：室溫
分子式：
C51H50Cl2N2O23
分子量：
1129.85
特點：
●激發(fā)波長480-500 nm，發(fā)射波長523-530 nm
●激光共聚焦，流式細(xì)胞儀均可檢測
選擇規(guī)格：
1mg
產(chǎn)品性狀
規(guī)格
性狀： 本產(chǎn)品為紅色粉末，使用時將固體溶解于無水DMSO中
純度（HPLC）: 98%以上
熒光光譜圖： 符合實驗要求
NMR光譜圖： 符合實驗要求
處理條件
保存方法 ： 避光冷凍
產(chǎn)品概述
Fluo 3-AM是一種檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光探針。Fluo 3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當(dāng)它與鈣離子Ca2+結(jié)合后熒光會增加60至80倍，是目前最常用的一種鈣離子熒光探針。激光共聚焦熒光顯微鏡具有氬激光器，所以Fluo 3可被廣泛使用于這種顯微鏡上。這種熒光信號發(fā)出來的長波也便于減小對樣品細(xì)胞的光損傷。Fluo 3也可用來檢測紫外光照射下可裂解的螯合鈣或其它形式的鈣。Fluo 3-AM是Fluo 3的一種乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易進(jìn)入細(xì)胞中。
原理
Fluo 3-AM (鈣離子熒光探針) 需用無水DMSO (anhydrous DMSO)配制。Fluo 3-AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。Fluo 3-AM進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo 3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo 3可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，最大激發(fā)波長為506nm，最大發(fā)射波長為526nm
激發(fā)發(fā)射波長
E x ：480-500 nm
E m ：525-530 nm
操作步驟
1、用 HBSS 溶液稀釋 1-5 mmol/l 的 Fluo 3-AM 母液，配制成 1-5 μmol/l的 Fluo 3-AM 工作液
（此濃度僅供參考，請根據(jù)具體實驗要求自行調(diào)整）。
例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 濃度為 5 μmol/l工作液的方法：用 1 ml HBSS 溶液稀釋 5 μl母液
即可。Fluo 3-AM 工作液需要即配即用，請勿反復(fù)凍存。如果Fluo 3-AM進(jìn)入細(xì)胞的效果不好，
可使用Pluronic?F-127，后者可以防止Fluo 3-AM在緩沖液里聚合并能促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞。
*Pluronic?F-127先用DMSO溶解至濃度為 20%（W/V），然后根據(jù)實驗需要直接加入Fluo 3-AM工作液
中至終濃度為 0.04-0.05%（此濃度僅供參考，請根據(jù)具體實驗要求自行調(diào)整）。
2、取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，用 HBSS 溶液洗滌細(xì)胞 3 次。
如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會分解 AM 體，從而降低 Fluo 3-AM 進(jìn)入細(xì)胞的效果。
另外含有酚紅的培養(yǎng)基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。
3、加入 Fluo 3-AM 工作液，溶液量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。
4、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育10-60分鐘，除去Fluo 3-AM工作液。關(guān)于孵育的時間，如果首次做實驗不能定，
建議先孵育 30 分鐘，看熒光效果：如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時間；如果熒光強(qiáng)度太弱，
適當(dāng)延長時間。
5、用 HBSS 溶液洗滌細(xì)胞 3 次以充分去除殘留的 Fluo 3-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆蓋細(xì)胞。
6、37℃培養(yǎng)箱孵育約 20-30 分鐘，以確保 AM 體在細(xì)胞內(nèi)的完全去酯化作用。
如果細(xì)胞內(nèi)酯酶活性較低，建議嚴(yán)格按照此操作進(jìn)行；酯酶活性高的細(xì)胞實驗，可以忽略此步。
7、用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測細(xì)胞，激發(fā)波長 480-500 nm，發(fā)射波長 525-530 nm。
注意事項
1、試劑容易吸潮，從冰箱取出后，請確認(rèn)在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑極其微量，
開封前，請輕彈管壁幾次，以保證粉末落入管底。
2、第一次使用時, 建議母液即配即用。試劑溶解后盡可能在短時間內(nèi)使用，以保證實驗效果。
3、溶解液DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導(dǎo)致AM體水解，使熒光染料無法進(jìn)入細(xì)胞，影響實驗效果。
4、母液遇水極易分解，如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成5 μl/管，用封口膜封口，并用
鋁箔紙包裹，放在一個密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。
5、建議您在正式實驗前先摸索一下細(xì)胞量、鈣離子熒光探針終濃度、培養(yǎng)時間等，找到最佳實驗條件。
實驗例
加載了Fluo 3的新鮮分離的大鼠肝臟細(xì)胞PE刺激后出現(xiàn)規(guī)則胞漿鈣振蕩。
上圖為細(xì)胞明場圖和不同時間點(min)的比例成像，
下圖為影響Fluo 3熒光強(qiáng)度隨時間的變化。
成像系統(tǒng)：Photon Technology International Inc.，
顯微鏡Nikon TE2000U，CCD相機(jī)QuantEM512S,軟件ERP。
(北京師范大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究所 崔宗杰教授 提供照片)
數(shù)據(jù)分析
計算公式：
[Ca2+]i = Kd×(F-Fmin) / (Fmax-F)
[Ca2+]i ：細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度
Kd：解離常數(shù)
F ：熒光強(qiáng)度
Fmin：Ca2+為零狀態(tài)下測得的熒光比值
Fmax：Ca2+為飽和狀態(tài)下測得的熒光比值
Q&A
| Q1:細(xì)胞內(nèi)檢測鈣離子的試劑種類都有什么，選擇什么樣的比較好呢？ |
| A1: 根據(jù)檢測儀器和檢測波長有很多的選擇，產(chǎn)品后面標(biāo)有AM的試劑是可以通過細(xì)胞膜的
有很多種相似的試劑，其特點如下：
【Fura 2】
?雙波長激發(fā)
激發(fā)(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、發(fā)射：λem=500 nm
?解離常數(shù)：224 nmol/L
?因為是熒光強(qiáng)度的比值、可以有效的減小誤差
=>細(xì)胞內(nèi)Ca濃度計算。
?該試劑被使用的最多
?必須要更換過濾片、會耽誤一些時間。
【Fluo 3】
?單波長激發(fā)
激發(fā)：λex=508 nm、發(fā)射：λem=527 nm
?解離常數(shù)：400 nmol/L
?因為激發(fā)光在長波段，所以對細(xì)胞的損傷比較小
（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。
?不適合切片中鈣離子的檢測
?【Fluo 4】
?單波長激發(fā)
?激發(fā)：λex=495 nm、發(fā)射：λem=518 nm
?解離常數(shù)：360 nmol/L
?與Fluo3相比對熒光強(qiáng)度更高。
?因為激發(fā)光在長波段，所以對細(xì)胞的損傷比較小
?（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。 ?與Fluo3相比對細(xì)胞的毒性低
?【Indo 1】
?單波長激發(fā)
?激發(fā)：λex= 330 nm、發(fā)射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)
?解離常數(shù)：250 nmol/L
?由于不需要更換濾光片，可以很快地檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化以及像心肌細(xì)胞運動中鈣離子的變化
?（需要兩臺檢測儀器）
?【Rhod 2】
?單波長激發(fā)
?激發(fā)：λex=553 nm、發(fā)射：λem=576 nm
?解離常數(shù)：1.0 μmol/L
?因為激發(fā)光在長波段，所以對細(xì)胞的損傷比較小
?（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。
?【Quin 2】
?單波長激發(fā)
?激發(fā)：λex=339 nm、發(fā)射：λem=492 nm
?解離常數(shù)：110 nmol/L
?最早開發(fā)的產(chǎn)品 |
?
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