Lipi-Green試劑貨號：LD02
脂滴檢測（綠色）
Lipi-Green
商品信息
儲存條件：在冷暗處保存
運輸條件：室溫
特點：
●高特異性脂滴定位
● 可進行組織脂滴成像
● 多種顏色可供選擇
選擇規(guī)格：
10nmol
湊單關(guān)聯(lián)產(chǎn)品TOP5
NO.1.Cell Counting Kit-8 細胞增殖毒性檢測
NO.2. Calcein-AM/PI Double Staining Kit活死細胞雙染
NO.3. Caspase-3 Assay Kit-Colorimetric-細胞凋亡檢測
NO.4. DALGreen – Autophagy Detection細胞自噬熒光探針
NO.5. GSSG/GSH Quantification Kit II氧化型/還原型谷胱甘肽
概述
Lipi系列探針是高脂肪親脂性小分子探針，其在疏水環(huán)境例如脂滴中發(fā)出強熒光。活細胞和固定細胞中的脂滴都可以使用本試劑清楚地觀察。
原理
脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪組成，主要包括甘油三酯和膽固醇酯，其外層被一層單層磷脂分子包裹。而且脂滴不僅在脂肪細胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明，以前認為脂滴僅是一個簡單的脂質(zhì)儲存器，但最近的研究表明其在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝1)，自噬2)和細胞衰老3)等方面都起著重要作用，因此需要進一步詳細地研究脂滴形成·成長·融合·分解的機制。Lipi系列探針是高脂肪親油性小分子探針，可在疏水環(huán)境例如脂滴中發(fā)出強熒光。Lipi探針染色后，無須洗滌即可觀察到脂滴。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂滴的染色例
在活細胞狀態(tài)下，用油酸誘導(dǎo)HeLa細胞后，用不同顏色的Lipi系列熒光探針檢測
檢測條件：
* Lipi-Blue ：Ex： 405 nm, Em： 450–500 nm
* Lipi-Green：Ex： 488 nm, Em：500–550 nm
* Lipi-Red：Ex： 561 nm, Em： 565–650 nm
* Lipi-Deep Red：Ex： 640 nm, Em： 650–700 nm
染色條件：
在HeLa細胞培養(yǎng)基中加入200 μmol/l油酸，過夜培養(yǎng)后，用PBS清洗細胞，并分別加入不同顏色的Lipi探針(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red： 1 μmol/l) 染色15 min后觀察。
如何制備油酸溶液
請參考Q&A“油酸溶液的制備和加入細胞的方法”。
與競爭品比較
Lipi系列熒光探針大幅度地改善了現(xiàn)有脂滴染色試劑存在的問題 (如選擇性，濾波器的適應(yīng)性，熒光滯留性)。而且 Lipi系列熒光探針也適用于多重染色實驗，可選顏色更多。
| 同仁化學(xué)試劑 |
其他品牌（T公司） |
|
Lipi-Blue |
Lipi-Green |
Lipi-Red |
Lipi-Deep Red |
Oil Red O
(比色) |
Nile Red |
試劑B |
| 活細胞染色 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
× |
〇 |
〇 |
| 固定細胞染色 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
| 對脂肪滴的選擇性
(低背景) |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
× |
× |
△ |
| 與其他試劑的共染色*1 |
〇 |
〇 |
〇*2 |
〇 |
n.d. |
×*3 |
〇 |
| 活細胞內(nèi)的滯留性(24h) |
〇 |
〇 |
× |
× |
n.d. |
× |
× |
*1. 關(guān)于共染色時推薦的熒光濾光片，您可以參考網(wǎng)頁下方Q&A“共染時推薦的熒光濾光片”。
*2. 與綠色熒光共染色時，推薦使用550 nm以下的綠色熒光濾光片。
*3. 用GFP的濾光片(500~540 nm)時會串色。
產(chǎn)品特點
特點1：與抗體檢測方法高度相似
用4％PFA固定HepG2細胞后，用100 nmol/l Lipi-Green染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗體熒光標(biāo)記，免疫染色， 該抗體可以特異性標(biāo)記脂滴膜上的蛋白質(zhì) (Adipophilin; ADFP)。 實驗證明Lipi-Green與脂滴上蛋白質(zhì)ADFP的定位高 度相關(guān)。
<檢測條件>
Lipi-Green：Ex：405 nm / Em:450-500 nm，
抗ADFP抗體(Alexa Fluor 647)：Ex：640 nm / Em:650-700 nm
特點2：高特異性定位脂滴
在HeLa活細胞中加入油酸，并用100 nmol/l Lipi-Green和100 nmol/l Nile Red（T公司）共染。右下圖中黃色熒光部分為Lipi-Green 和Nile Red共染上的部分，結(jié)果顯示Nile Red會染上脂滴以外的其它細胞質(zhì)。
<檢測條件>
Lipi-Green：Ex: 488 nm / Em: 500 – 550 nm
Nile Red：Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
特點3：熒光在細胞中滯留時間長
分別用Lipi系列、Nile Red和市售的試劑B染色HepG2細胞，觀察在培養(yǎng)30 min和24 h時的熒光圖像。
實驗證實Lipi-Blue和Lipi-Green在培養(yǎng)24 h后雖然熒光強度有所降低，但仍有熒光。 而Lipi-Red，Lipi-Deep Red，Nile Red和市售試劑B在 培養(yǎng)24 h后幾乎無熒光，不適合長時間的實時成像觀察。
實驗例
實驗例1：脂肪細胞的脂滴成像
用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪細胞，可以清楚地檢測出脂肪細胞中的脂質(zhì)。
<脂肪細胞染色實驗例>
(1)將3T3-L1細胞(1.5×104cells/孔)接種在μ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
(2)按照常規(guī)方法誘導(dǎo)分化為脂肪細胞。
(3)去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 無酚紅）洗滌兩次。
(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，無酚紅）制備的每種染料的工作溶液，并在37℃下培養(yǎng)24 h。
(5)用熒光顯微鏡觀察。
※試劑濃度：各2.5 μmol/l
實驗例2：脂肪組織的脂滴成像
用4%PFA固定小鼠肝臟脂肪組織(冰凍切片)后用Lipi系列染色，比較幼鼠(6周齡)和老年小鼠(31周齡)的脂滴成像圖像，發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪組織中的脂滴量有很大差異。
<組織樣品的染色實驗例>
(1)向小鼠肝臟脂肪組織(冰凍切片)中加入4%PFA(PBS)，在室溫下靜置5 min。
(2)用PBS清洗后，加入各濃度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下靜置24 h。
(3)用PBS清洗后，用落射型熒光顯微鏡進行熒光觀察。
※工作液濃度：2.5 μmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 μmol/l(Lipi-Red)
實驗例3：利用高內(nèi)含成像技術(shù)對藥物引起的脂質(zhì)性肝臟毒性的研究
將普萘洛爾（交感神經(jīng)β受體阻斷劑）加入人肝癌細胞系（HepG2細胞）后，用熒光顯微鏡觀察脂肪滴的變化。通過熒光圖像中脂肪滴的數(shù)量、面積和熒光強度的變化分析脂肪滴的積累情況。
脂肪滴的熒光成像
細胞核(Blue)：Ex.385nm/Em. 460 nm
脂肪滴(Green)：Ex.475nm/Em. 535 nm
藥物處理對脂肪滴積累的分析
通過分析熒光圖像中的細胞數(shù)量和脂肪滴的面積、數(shù)量和熒光強度來了解細胞積累脂肪滴的情況。結(jié)果顯示，脂肪滴的數(shù)量和面積隨著普萘洛爾濃度的增加而上升，在濃度超過20μmol/l的條件下，脂肪滴的形成非常明顯。DS-Qi2熒光顯微鏡可在一次拍攝中捕捉到廣泛的細胞區(qū)域，而NIS-Elements軟件的EDF模塊可對所有脂肪滴進行更詳細的定量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
<檢測儀器>
高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(HTC)
(尼康：https://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/high-content-imaging)
“有關(guān)染色操作、詳細的分析方法等請參考尼康網(wǎng)站的 “Application Notes:Hepatotoxicity test of drug-induced lipidosis using high-content imaging”。
Lipi系列熒光圖譜
脂肪滴產(chǎn)品種類的檢測方法
|
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號 |
| 成像(成像)
脂滴熒光探針 |
Lipi-Blue |
10 nmol |
LD01 |
| Lipi-Green |
10 nmol |
LD02 |
| Lipi-Red |
100 nmol |
LD03 |
| Lipi-Deep Red |
10 nmol |
LD04 |
| 定量（熒光酶標(biāo)儀，F(xiàn)CM）
脂滴熒光檢測試劑盒 |
Lipid Droplet Assay Kit – Blue |
1 set |
LD05 |
| Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red |
1 set |
LD06 |
常見問題Q&A
| Q1：油酸溶液的制備和加入細胞的方法 |
| A1：我們按照以下步驟制備和使用油酸溶液。
<油酸儲存溶液>
必要的試劑
·BSA(牛血清白蛋白)
·油酸
·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0)
制備步驟
1)在0.1 mol/l Tris-HCl（pH8.0）中加入BSA并溶解（BSA：濃度0.14 g/ml）。
2)在容器(一次性的離心管)中加入油酸后，加入步驟1）得到的BSA溶液，使用渦旋振蕩器進行混合(油酸濃度：4 mmol/l)。*1
3)用孔徑為0.22 μm的注射式過濾器(PTFE)過濾步驟2)的混合溶液。
4)每次使用后冷藏保存。*2
* 1 油酸和BSA溶液混合可能導(dǎo)致液體混濁，繼續(xù)搖動讓油酸和BSA形成復(fù)合物使混濁會消失。
* 2 將所需量的油酸儲備溶液加入到實驗使用的培養(yǎng)基中，用于將油酸加入到細胞中。
<加入細胞的方法>
1)將細胞在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。
2)用加入了油酸儲備溶液的培養(yǎng)基(油酸的終濃度200 μmol/L)替換，再培養(yǎng)24 h。
3)然后按照說明書對脂滴進行熒光染色觀察。 |
| Q2：共染時推薦的熒光濾光片。 |
|
|
| Q3：檢測不到熒光信號的應(yīng)對方法是什么？ |
| Q4如果沒有檢測到熒光信號，可能會有幾個因素。
請確認以下內(nèi)容，并根據(jù)情況考慮優(yōu)化條件。
1.激發(fā)·發(fā)射波長與染料的熒光特性不一致。
確認說明書上的熒光圖譜和您儀器的激發(fā)和發(fā)射波長是否匹配。
2.染色條件不是最合適的。
[試劑濃度]
確認工作液的濃度是否在以下范圍內(nèi)。
Lipi-Blue，Lipi-Green：0.1-0.5μmol/l
Lipi-Red：1-5μmol/l
*如果在上述條件下仍未檢測到熒光信號，請?zhí)岣呷旧珴舛取?
Lipi-Blue，Lipi-Green：1-2μmol/l
Lipi-Red：10-20μmol/l
[染色時間]
-一般是30min，如沒有熒光信號可以延長染色時間至1-2 h。
3.固定條件不適合。
根據(jù)細胞種類不同，染色前后的固定操作可能會導(dǎo)致無法染色或靈敏度減弱。
在這種情況下，“請參考Q&A：是否可以對固定細胞進行染色？。
4.脂滴小，難以確認。
根據(jù)細胞的不同，可能會有脂滴很小難以確認的情況。
這種情況下，我們建議在高倍率的顯微鏡下確認，或用油酸處理細胞作為陽性對照進行評估。 |
| Q4：是否可以對固定細胞進行染色? |
| A4：可以染色，固定細胞的染色步驟有以下注意事項：
※請用多聚甲醛 (PFA) 固定細胞，不建議用甲醇等醇類固定細胞，因為可能會影響脂滴的結(jié)構(gòu)。
※部分細胞種類染色后，如果在固定細胞過程中出現(xiàn)無染色或染色強度不夠的情況，需要摸索最佳固定條件。
○細胞染色后固定實驗例 (以HepG2細胞為例)
1. 將HepG2細胞接種在μ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
2. 去除培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。
3. 在細胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min。
4. 去除上清液，用PBS清洗2次。
5. 加入4% PFA (在PBS中)，在室溫固定5 min。
6. 去除上清液，用PBS清洗后，在熒光顯微鏡下觀察。
○細胞染色前固定實驗例 (以HeLa細胞為例)
1. 將HeLa細胞接種在μ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
2. 去除培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。
3. 加入4% PFA (在PBS中)，在室溫固定5 min。
4. 去除上清液，用PBS清洗2次。
5. 在細胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。
6. 去除上清液，用PBS清洗后，在熒光顯微鏡下觀察。 |
| Q5：Lipi-Green可以用流式細胞儀檢測嗎？ |
| A5：Lipi-Green不能用于流式，但Lipi-Blue或Lipi-Deep Red可以用。
我們還特別準(zhǔn)備了可以便于定量檢測的試劑盒。
產(chǎn)品名稱 貨號
Lipid Droplet Assay Kit – Blue LD05
Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red LD06 |
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