Lipi-Red試劑貨號(hào)：LD03
脂滴檢測（紅色）
Lipi-Red
商品信息
儲(chǔ)存條件：在冷暗處保存
運(yùn)輸條件：室溫
特點(diǎn)：
●高特異性脂滴定位
● 可進(jìn)行組織脂滴成像
● 多種顏色可供選擇
選擇規(guī)格：
100nmol
湊單關(guān)聯(lián)產(chǎn)品TOP5
NO.1.Cell Counting Kit-8 細(xì)胞增殖毒性檢測
NO.2.FerroOrange細(xì)胞亞鐵離子檢測
NO.3. Glucose Assay Kit-WST葡萄糖檢測
NO.4. Liperfluo細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物檢測
NO.5. MitoPeDPP線粒體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物檢測
概述
Lipi系列探針是高脂肪親脂性小分子探針，其在疏水環(huán)境例如脂滴中發(fā)出強(qiáng)熒光。活細(xì)胞和固定細(xì)胞中的脂滴都可以使用本試劑清楚地觀察。
原理
脂滴(脂肪滴，Lipid droplets, LDs)由中性脂肪組成，主要包括甘油三酯和膽固醇酯，其外層被一層單層磷脂分子包裹。而且脂滴不僅在脂肪細(xì)胞中存在，在真核生物中也普遍存在。最新的研究表明，以前認(rèn)為脂滴僅是一個(gè)簡單的脂質(zhì)儲(chǔ)存器，但最近的研究表明其在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝1)，自噬2)和細(xì)胞衰老3)等方面都起著重要作用，因此需要進(jìn)一步詳細(xì)地研究脂滴形成·成長·融合·分解的機(jī)制。Lipi系列探針是高脂肪親油性小分子探針，可在疏水環(huán)境例如脂滴中發(fā)出強(qiáng)熒光。Lipi探針染色后，無須洗滌即可觀察到脂滴。
1) T. Fujimoto et al., “Lipid droplets: a classic organelle with new outfits.” Histochem Cell Biol., 2008, 130(2), 263.
2) R. Singh et al., “Autophagy regulates lipid metabolism.” Nature, 2009, 458(7242), 1131.
3) M. Yokoyama et al., “Inhibition of endothelial p53 improves metabolic abnormalities related to dietary obesity.” Cell Reports, 2014, 7(5), 1691.
脂滴的染色例
在活細(xì)胞狀態(tài)下，用油酸誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞后，用不同顏色的Lipi系列熒光探針檢測
檢測條件：
* Lipi-Blue ：Ex：405 nm, Em：450–500 nm
* Lipi-Green：Ex：488 nm, Em：500–550 nm
* Lipi-Red：Ex：561 nm, Em：565–650 nm
* Lipi-Deep Red：Ex：640 nm, Em：650–700 nm
染色條件：
在HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基中加入200 μmol/l油酸，過夜培養(yǎng)后，用PBS清洗細(xì)胞，并分別加入不同顏色的Lipi探針(Lipi-Blue/Green/Deep Red：0.1 μmol/l、Lipi-Red： 1 μmol/l) 染色15 min后觀察。
如何制備油酸溶液
請(qǐng)參考Q&A“油酸溶液的制備和加入細(xì)胞的方法”。
與競爭品比較
Lipi系列熒光探針大幅度地改善了現(xiàn)有脂滴染色試劑存在的問題 (如選擇性，濾波器的適應(yīng)性，熒光滯留性)。而且 Lipi系列熒光探針也適用于多重染色實(shí)驗(yàn)，可選顏色更多。
| 同仁化學(xué)試劑 |
其他品牌（T公司） |
|
Lipi-Blue |
Lipi-Green |
Lipi-Red |
Lipi-Deep Red |
Oil Red O
(比色) |
Nile Red |
試劑B |
| 活細(xì)胞染色 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
× |
〇 |
〇 |
| 固定細(xì)胞染色 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
| 對(duì)脂肪滴的選擇性
(低背景) |
〇 |
〇 |
〇 |
〇 |
× |
× |
△ |
| 與其他試劑的共染色*1 |
〇 |
〇 |
〇*2 |
〇 |
n.d. |
×*3 |
〇 |
| 活細(xì)胞內(nèi)的滯留性(24h) |
〇 |
〇 |
× |
× |
n.d. |
× |
× |
*1. 關(guān)于共染色時(shí)推薦的熒光濾光片，您可以參考網(wǎng)頁下方Q&A“共染時(shí)推薦的熒光濾光片”。
*2. 與綠色熒光共染色時(shí)，推薦使用550 nm以下的綠色熒光濾光片。
*3. 用GFP的濾光片(500~540 nm)時(shí)會(huì)串色。
產(chǎn)品特點(diǎn)
特點(diǎn)1：與抗體檢測方法高度相關(guān)
用4％PFA固定HepG2細(xì)胞后，用1 μmol/l Lipi-Red 染色。 然后在脂滴膜上用抗ADFP抗體熒光標(biāo)記，免疫染色，該抗體可以特異性標(biāo)記脂滴膜上的蛋白質(zhì) (Adipophilin; ADFP)。實(shí)驗(yàn)證明Lipi-Red 與脂滴上蛋白質(zhì)ADFP的定位高度相關(guān)。
<檢測條件>
Lipi-Red：Ex: 405 nm / Em: 450-500 nm，
抗ADFP抗體(Alexa Fluor 647)：Ex: 640 nm / Em: 650-700 nm
特點(diǎn)2：高特異性定位脂滴
在HeLa活細(xì)胞中加入油酸，并用1μmol/L Lipi-Red和100 nmol/l Nile Red（T公司）染色。該結(jié)果顯示Nile Red會(huì)染上脂滴以外的其它細(xì)胞質(zhì)。
<檢測條件>
Lipi-Red：Ex: 561 nm / Em: 565 – 650 nm
Nile Red：Ex: 561 nm / Em: 565-650 nm
特點(diǎn)3：光譜范圍更窄，不易串色(Lipi-Red vs Nile Red)
在單通道情況下，Lipi Red和Nile Red（T公司）染色HepG2會(huì)用G激發(fā)觀察紅色熒光。而在多重染色情況下，可能會(huì)用B激發(fā)觀察綠色熒光，此時(shí)Nile Red會(huì)出現(xiàn)串色現(xiàn)象。
在用Lipi-Red染色的細(xì)胞中，確認(rèn)了由于G激發(fā)引起的紅色熒光，并且沒有確認(rèn)由于B激發(fā)引起的綠色熒光泄漏。 另一方面，在用尼羅紅染色的細(xì)胞中，觀察到由于G激發(fā)引起的紅色熒光，但是由于B激發(fā)而觀察到綠色熒光的泄漏。
特點(diǎn)4：熒光在細(xì)胞中的滯留時(shí)間長
分別用Lipi系列、Nile Red和市售的試劑B染色HepG2細(xì)胞，觀察在培養(yǎng)30 min和24 h的熒光圖像。
實(shí)驗(yàn)例
用Lipi系列染色3T3-L1前脂肪細(xì)胞，可以清楚地檢測出脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)。
<脂肪細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)例>
(1)將3T3-L1細(xì)胞(1.5×104cells/孔)接種在μ-Plate 96孔板（ibidi）的各孔中，并在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
(2)按照常規(guī)方法誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。
(3) 去除上清液，用DMEM（25 mmol/l葡萄糖, 10% FBS, 無酚紅）洗滌兩次。
(4)加入用DMEM（25 mmol/l葡萄糖，10％FBS，無酚紅）制備的每種染料的工作溶液，并在37℃下培養(yǎng)24 h。
(5)用熒光顯微鏡觀察。
※試劑濃度：各2.5 μmol/l
實(shí)驗(yàn)例2：脂肪組織的脂滴成像
用4%PFA固定小鼠肝臟脂肪組織(冰凍切片)后用Lipi系列染色，比較幼鼠(6周齡)和老年小鼠(31周齡)的脂滴成像圖像，發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪組織中的脂滴量有很大差異。
<組織樣品的染色實(shí)驗(yàn)例>
(1)向小鼠肝臟脂肪組織(冰凍切片)中加入4%PFA(PBS)，在室溫下靜置5 min。
(2)用PBS清洗后，加入各濃度的Lipi系列working solution（PBS），在4℃下靜置24 h。
(3)用PBS清洗后，用落射型熒光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。
※工作液濃度：2.5 μmol/l(Lipi-Blue、Lipi-Green、Lipi-Deep Red)、25 μmol/l(Lipi-Red)
實(shí)驗(yàn)例3：使用細(xì)胞成像儀進(jìn)行定量分析
將油酸或Triacsin C(acyl-CoA synthetase抑制劑）分別加入到HepG2細(xì)胞中，并比較脂滴的變化。在分析中，我們使用共聚焦定量細(xì)胞成像儀(橫河電機(jī)株式會(huì)社 CQ1)獲得每個(gè)細(xì)胞脂滴數(shù)量和面積的數(shù)據(jù)。
脂肪滴和細(xì)胞核的成像
使用共聚焦定量細(xì)胞成像儀在617/73 nm處拍攝脂滴圖像，在447/60 nm處拍攝細(xì)胞核圖像，在分析軟體CellPathfinder中識(shí)別單個(gè)脂滴和細(xì)胞核，并計(jì)算其數(shù)量和面積。
橫河電機(jī)CQ1拍攝條件
使用板：96 well plate，物鏡：20倍
激發(fā)波長 ：405 nm (DAPI)：)：藍(lán)色、561 nm (Lipi-Red)： 紅色
紫框線：細(xì)胞核、黃框線：脂滴
脂滴數(shù)量及面積的分析
根據(jù)細(xì)胞核和脂滴的檢測數(shù)據(jù)，每個(gè)細(xì)胞的脂滴的數(shù)量和面積如圖所示。結(jié)果，加入油酸的脂滴增加了7-13倍，而加入Triacsin C抑制了脂滴的形成，脂滴數(shù)量減少到Control組的60%。
細(xì)胞處理及脂滴染色條件
將HepG2細(xì)胞(1×103cells)接種到96孔板中過夜培養(yǎng)。除去培養(yǎng)上清液后，加入未處理（僅含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基）、油酸（含200 μmol/l油酸和FBS的DMEM培養(yǎng)基）或Triacsin C（含5 μmol/l Triacsin C和FBS的DMEM培養(yǎng)基）過夜培養(yǎng)。之后用PBS 清洗2次，用4%的PFA在室溫下固定5 min后，用PBS 清洗2次。最后，加入1 μmol/l Lipi-Red working solution 在室溫、避光下染色2 h后，用共聚焦定量細(xì)胞成像儀進(jìn)行定量分析。
Lipi系列熒光圖譜
脂肪滴產(chǎn)品種類的檢測方法
|
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
| 成像(成像)
脂滴熒光探針 |
Lipi-Blue |
10 nmol |
LD01 |
| Lipi-Green |
10 nmol |
LD02 |
| Lipi-Red |
100 nmol |
LD03 |
| Lipi-Deep Red |
10 nmol |
LD04 |
| 定量（熒光酶標(biāo)儀，F(xiàn)CM）
脂滴熒光檢測試劑盒 |
Lipid Droplet Assay Kit – Blue |
1 set |
LD05 |
| Lipid Droplet Assay Kit – Deep Red |
1 set |
LD06 |
常見問題Q&A
| Q1：油酸溶液的制備和加入細(xì)胞的方法 |
| A1：我們按照以下步驟制備和使用油酸溶液。
<油酸儲(chǔ)存溶液>
必要的試劑
·BSA(牛血清白蛋白)
·油酸
·0.1 mol/l Tris-HCl(pH8.0)
制備步驟
1)在0.1 mol/l Tris-HCl（pH8.0）中加入BSA并溶解（BSA：濃度0.14 g/ml）。
2)在容器(一次性的離心管)中加入油酸后，加入步驟1）得到的BSA溶液，使用渦旋振蕩器進(jìn)行混合(油酸濃度：4 mmol/l)。*1
3)用孔徑為0.22 μm的注射式過濾器(PTFE)過濾步驟2)的混合溶液。
4)每次使用后冷藏保存。*2
* 1 油酸和BSA溶液混合可能導(dǎo)致液體混濁，繼續(xù)搖動(dòng)讓油酸和BSA形成復(fù)合物使混濁會(huì)消失。
* 2 將所需量的油酸儲(chǔ)備溶液加入到實(shí)驗(yàn)使用的培養(yǎng)基中，用于將油酸加入到細(xì)胞中。
<加入細(xì)胞的方法>
1)將細(xì)胞在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。
2)用加入了油酸儲(chǔ)備溶液的培養(yǎng)基(油酸的終濃度200 μmol/L)替換，再培養(yǎng)24 h。
3)然后按照說明書對(duì)脂滴進(jìn)行熒光染色觀察。 |
| Q2：共染時(shí)推薦的熒光濾光片。 |
|
|
| Q3：檢測不到熒光信號(hào)的應(yīng)對(duì)方法是什么？ |
| Q4如果沒有檢測到熒光信號(hào)，可能會(huì)有幾個(gè)因素。
請(qǐng)確認(rèn)以下內(nèi)容，并根據(jù)情況考慮優(yōu)化條件。
1.激發(fā)·發(fā)射波長與染料的熒光特性不一致。
確認(rèn)說明書上的熒光圖譜和您儀器的激發(fā)和發(fā)射波長是否匹配。
2.染色條件不是最合適的。
[試劑濃度]
確認(rèn)工作液的濃度是否在以下范圍內(nèi)。
Lipi-Blue，Lipi-Green：0.1-0.5μmol/l
Lipi-Red：1-5μmol/l
*如果在上述條件下仍未檢測到熒光信號(hào)，請(qǐng)?zhí)岣呷旧珴舛取?
Lipi-Blue，Lipi-Green：1-2μmol/l
Lipi-Red：10-20μmol/l
[染色時(shí)間]
-一般是30min，如沒有熒光信號(hào)可以延長染色時(shí)間至1-2 h。
3.固定條件不適合。
根據(jù)細(xì)胞種類不同，染色前后的固定操作可能會(huì)導(dǎo)致無法染色或靈敏度減弱。
在這種情況下，“請(qǐng)參考Q&A：是否可以對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行染色？。
4.脂滴小，難以確認(rèn)。
根據(jù)細(xì)胞的不同，可能會(huì)有脂滴很小難以確認(rèn)的情況。
這種情況下，我們建議在高倍率的顯微鏡下確認(rèn)，或用油酸處理細(xì)胞作為陽性對(duì)照進(jìn)行評(píng)估。 |
| Q4：是否可以對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行染色? |
| A4：可以染色，固定細(xì)胞的染色步驟有以下注意事項(xiàng)：
※請(qǐng)用多聚甲醛 (PFA) 固定細(xì)胞，不建議用甲醇等醇類固定細(xì)胞，因?yàn)榭赡軙?huì)影響脂滴的結(jié)構(gòu)。
※部分細(xì)胞種類染色后，如果在固定細(xì)胞過程中出現(xiàn)無染色或染色強(qiáng)度不夠的情況，需要摸索最佳固定條件。
○細(xì)胞染色后固定實(shí)驗(yàn)例 (以HepG2細(xì)胞為例)
1. 將HepG2細(xì)胞接種在μ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
2. 去除培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。
3. 在細(xì)胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min。
4. 去除上清液，用PBS清洗2次。
5. 加入4% PFA (在PBS中)，在室溫固定5 min。
6. 去除上清液，用PBS清洗后，在熒光顯微鏡下觀察。
○細(xì)胞染色前固定實(shí)驗(yàn)例 (以HeLa細(xì)胞為例)
1. 將HeLa細(xì)胞接種在μ-Slide 8孔板上，并在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
2. 去除培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。
3. 加入4% PFA (在PBS中)，在室溫固定5 min。
4. 去除上清液，用PBS清洗2次。
5. 在細(xì)胞中加入用PBS配制的Lipi工作液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。
6. 去除上清液，用PBS清洗后，在熒光顯微鏡下觀察。 |
| Q5：綠色濾光片會(huì)有熒光泄露嗎。 |
| A5：與市場上的Nile Red相比，Lipi-Red的泄漏較少，但根據(jù)濾光片的種類和激發(fā)光的強(qiáng)度，熒光又可能會(huì)泄漏到綠色濾光片中。在觀察帶有不同染料的綠色濾光片時(shí)，請(qǐng)注意以下幾點(diǎn)。
·選擇550 nm以下綠色熒光濾光片。
·一邊調(diào)整激發(fā)光的強(qiáng)度，一邊檢測熒光。 |
?
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