Qiagen EndoFree Plasmid Giga Kit (5)
純化得到至多10mg的無(wú)內(nèi)毒素高轉(zhuǎn)染級(jí)純質(zhì)粒或柯斯質(zhì)粒DNA
純化得到的DNA內(nèi)毒素水平低于0.1 EU/µg
純化流程快，同時(shí)去除內(nèi)毒素
獲得高產(chǎn)量、高拷貝質(zhì)粒DNA
使用LyseBlue，獲得的裂解和高產(chǎn)量的DNA
EndoFree Plasmid Kits基于陰離子交換技術(shù)，可快速制備不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA。QIAfilter Cartridges過(guò)濾快速澄清裂解液，DNA的產(chǎn)量500μg（Maxi）、2.5mg（Mega）和10mg（Giga）。制備的DNA 純度超過(guò)兩次CsCl梯度離心法所得DNA的純度，適合超轉(zhuǎn)染級(jí)純的應(yīng)用。
原理
純化的質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素污染水平取決于所用的純化方法（參見(jiàn)"Endotoxin levels in plasmid preparations"）。硅膠技術(shù)純化的DNA具有非常高的內(nèi)毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和兩次CsCl超速離心可獲得相對(duì)低水平內(nèi)毒素的純DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的內(nèi)毒素去除步驟，獲得<0.1EU/µg的質(zhì)粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊設(shè)計(jì)的過(guò)濾裝置，用于代替細(xì)菌細(xì)胞堿裂解后的離心步驟。QIAfilter Cartridges可wanquan去除SDS沉淀，清除細(xì)菌裂解液，相比離心可大量節(jié)約時(shí)間，減少1小時(shí)的質(zhì)粒純化時(shí)間。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用內(nèi)部真空方式輕松高效的清除大量細(xì)菌裂解液（注意：該試劑盒不包含瓶子）。
QIAGEN-tips中dute的陰離子交換樹(shù)脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）專(zhuān)為核酸純化而開(kāi)發(fā)。它的分離性能使得DNA純度與連續(xù)兩次CsCl梯度離心獲得的DNA純度相當(dāng)。由重力流驅(qū)動(dòng)并持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的預(yù)裝 QIAGEN-tips，限度減少手動(dòng)制備質(zhì)粒所需的時(shí)間。整個(gè)QIAGEN質(zhì)粒純化系統(tǒng)不使用有毒物質(zhì)，如benfen，氯仿，溴化乙錠和CsCl，限 度地減少對(duì)用戶(hù)和環(huán)境的危害。
內(nèi)毒素，又稱(chēng)脂多糖或LPS，是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的組成部分，如大腸桿菌（參見(jiàn)Bacterial cell wall）。 內(nèi)毒素在質(zhì)粒裂解純化過(guò)程中釋放出來(lái)，并顯著降低內(nèi)毒素敏感細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率。此外，內(nèi)毒素與DNA競(jìng)爭(zhēng)“自由"轉(zhuǎn)染試劑，影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒DNA的攝 取。內(nèi)毒素也誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)生非特異性免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染結(jié)果的誤讀。這些反應(yīng)包括誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)，如IL-1和前列腺素等的 合成。總體而言，內(nèi)毒素在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中是不可控變量，影響結(jié)果的可重復(fù)性，使它們難以對(duì)比、解讀。在基因治療研究中，內(nèi)毒素可造成內(nèi)毒素休克綜合癥和激活補(bǔ) 體級(jí)聯(lián)，干擾研究。
Qiagen EndoFree Plasmid Giga Kit (5)
操作流程
在堿性條件下，細(xì)菌細(xì)胞裂解，使用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。將Endotoxin Removal Buffer加入到過(guò)濾后的裂解液中。冰浴后，將純凈的裂解物上樣到陰離子交換柱上，在適當(dāng)?shù)牡望}和pH條件下，質(zhì)粒DNA選擇性結(jié)合。用中鹽緩沖液清除 RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他低分子量雜質(zhì)，超純質(zhì)粒DNA被高鹽緩沖液洗脫（參見(jiàn)QIAGEN Plasmid Kit procedures）。最后DNA由異丙醇脫鹽、沉淀并且離心回收。
應(yīng)用
使用EndoFree Plasmid Kits純化的DNA適合多種敏感應(yīng)用，包括：
轉(zhuǎn)染，包括原代、敏感以及懸浮細(xì)胞
基因治療研究
基因沉默
顯微注射
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