新型親和性外泌體純化法與外泌體高靈敏度檢測應用
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新型親和性外泌體純化法與外泌體高靈敏度檢測應用◆前言
外泌體是各種細胞外泌的直徑在30-100nm之間的膜囊泡。因外泌體內含mRNA、microRNA等核酸和蛋白質對相鄰細胞具有交換信息的功能。作為細胞間信號傳導的通訊工具和作為癌等各種疾病的生物標記話題比較熱議[1][2]。因此，這幾年各領域關于外泌體研究很廣泛，但是在現實的外泌體實驗技術的發展中，關于需要改進的課題存在很多。例如，在外泌體純化方法中超離心分離法和多聚體沉淀法（市售試劑盒），容易混入多種雜質，在后續實驗中增加了很多障礙。另一方面，抗體親和性和密度梯度離心可獲得高純度外泌體，但是不能獲得完整狀態。因此存在著不能分析外泌體完整狀態下的生理功能。作為外泌體進一步檢測方法，免疫印跡和ELISA被廣泛應用。但是存在著需要大量外泌體樣本和標記蛋白量少導致檢測較困難的問題。
因此本文為了解決外泌體實驗技術中各種課題，我們關于開發的新型外泌體分析工具進行了說明。
◆磷脂酰絲氨酸親和性新型外泌體純化法
外泌體膜雖然含有分泌細胞源蛋白質和脂質，但眾所周知磷脂酰絲氨酸（PS）在活細胞通過翻轉酶作用導向細胞膜內側，也會暴露在外泌體膜外側[3]。另外，被作為通過巨噬細胞進行細胞凋亡的吞噬受體T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4(Tim4)蛋白質通過細胞外域IgV域與含有鈣離子的PS結合[4]。以上述知識為參考，我們利用Tim4固化磁珠，在鈣離子存在下捕捉培養上清和血清等樣品中的外泌體，再添加螯合劑可純化外泌體，這種劃時代外泌體純化方法是和金澤大學醫學系免疫學華山教授共同開發，并取得了成功。[5]并且MagCapture™Exosome Isolation Kit PS實現了比以前的外泌體純化法更加簡捷地純化高純度完整狀態的外泌體。這是迄今為止取代黃金標準超速離心法的新型外泌體純化法。（圖1）
◆PS Capture™ExosomeELISA Kit的特點和使用案例
PS Capture™Exosome ELISA Kit是Tim4蛋白通過PS和外泌體親和性結合的應用ELISA試劑盒。本試劑盒將外泌體表面標記蛋白的抗體固相化，相比以前的ELISA法，可高靈敏度檢測外泌體。此方法是將培養上清和血清等含有外泌體的樣本添加到Tim4蛋白包被的干板，在鈣離子存在下捕獲外泌體，通過對外泌體表面標記蛋白質進行一抗結合反應和二抗結合反應，從而完成對外泌體檢測（圖2）。此外，本試劑盒附加了可作為一抗的小鼠抗CD63單抗，但除此之外，如果測定外泌體表面標記的話，需提前準備小鼠源一抗方可檢測外泌體。
本試劑盒最大特點就是實現了比免疫印跡和已有的Exosome ELISA產品更高靈敏度檢測外泌體。首先，為了用本試劑盒和免疫印跡法比較檢測靈敏度，在免疫印跡實驗中需要檢查外泌體檢測極限值（圖3a）。結果顯示，以人結腸癌細胞的COLO201細胞源純化外泌體作為樣本通過抗CD63單抗進行免疫印跡實驗，檢測出蛋白質含量75ng的外泌體。然后，用本試劑盒檢測純化的白血病源細胞株K562細胞以及COLO201細胞源外泌體的ELISA檢測極限值，K562細胞源外泌體的檢測極限值為49.9pg，COLO201細胞源外泌體檢測極限值為10.9pg。免疫印跡實驗實際具有1000倍以上的檢測靈敏度（圖3b）。另外，已有Exosome ELISA產品的靈敏度在數ng~μg之間（參考各產品手冊），但是本試劑盒通過PS與Tim4蛋白親和性結合比原來外泌體表面標記抗體包被ELISA法在靈敏度上高出100倍以上。
最后，本試劑盒的使用案例為各種細胞源外泌體表面標記蛋白的表達分析。用13種細胞培養上清純化的外泌體各1ng，通過外泌體標記蛋白CD9/CD63/CD81的抗體進行ELISA檢測（圖4）。結果顯示，在各外泌體中表面標記蛋白的存在比例因來源細胞不同而存在明顯差異。有的細胞株分泌不具有特定標記蛋白的外泌體，外泌體異質性高且明顯的數據說明本試劑盒的ELISA系統是十分優質的。
◆結論
綜上所述，利用Tim4蛋白的PS親和性原理的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS實現了可簡便高靈敏度純化外泌體。PS Capture™ Exosome ELISA Kit是高靈敏度檢測外泌體的劃時代產品。為此，通過使用本試劑盒對原方法混入雜質后外泌體標記蛋白確認分類問題和至今為止免疫印跡實驗以及已有Exosome ELISA產品微量表面標記蛋白檢測困難等問題都可解決。今后本公司將會利用Tim4蛋白的PS親和性能開發外泌體研究相關試劑。真誠希望這些產品為外泌體研究發展做出貢獻。
參考文獻
[1] Tkach, M. et al. : Cell, 164, 1226 （2016）.
[2] Raimondo, F. et al. : Proteomics,11, 709 （2011）.
[3] Trajkovic, K. et al. : Science,319 （5867）, 1244 （2008）.
[4] Miyanishi, M. et al. : Nature, 450, 435 （2007）.
[5] Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 （2016）.
◆相關產品
1. Exosome外泌體試劑盒
2. PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD）
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