SABC(小鼠IgG)-POD?kit-切片與免疫組化-蛋白與免疫
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SABC(小鼠IgG)-PODkit| 英文名稱 | SABC(Mouse IgG)-POD Kit |
|---|---|
| 儲存條件 | -20℃長期保存 |
| 單位 | 盒 |
產品內容：
封閉液（5% BSA） 10ml 3% H2O2 10ml Bio-羊抗小鼠IgG濃縮液 100ul SABC-POD濃縮液 100ul 稀釋液 30ml 20×DAB顯色液A 1ml 20×DAB顯色液B 1ml保存：
如果長時間不使用，請將所有試劑存放于-20℃，如經常使用，可將封閉液，3% H2O2和20×DAB顯色液B存放于2-8℃以方便使用。
產品說明：
本試劑盒適合于一抗為小鼠IgG的免疫組化實驗DAB顯色。 SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測而設計的，用以顯示組織和細胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質，同親和素一樣，對生物素有極高的親和力，親和素是一個堿性蛋白質（PI=10），經改造后可以轉變成中性蛋白質。鏈霉親和素等電點接近中性，對組織和細胞的非特異吸附很低，因此基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex，SABC大約可形成一百個左右的過氧化物酶和五十個左右的鏈霉親和素所構成的復合物。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。
操作步驟:（以石蠟切片為例）
1. 切片常規脫蠟至水(三次二甲苯，三次乙醇)。
2. 3% H2O2室溫處理5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
3.可選步聚：
a、熱修復抗原，將切片浸入0.01M檸檬酸鈉緩沖液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰 后斷電，間隔5-10分鐘后，反復1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。 b、酶消化，滴加消化液，37℃10分鐘，PBS（pH7.2-7.4）洗滌2-3次。c、跳過此步，直接進入下一步。
4. 滴加5% BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 免洗。
5. 用稀釋液將一抗按一定比例稀釋（稀釋后的一抗4℃可保存一周），也可另行購買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗37℃ 孵育1小時左右或20℃ 2小時左右，也可4℃過夜。PBS（pH7.2-7.4）洗滌3次，每次2分鐘。（一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度、背景有直接關系。一般來說，陽性染色強度不夠時，可提高一抗濃度和延長孵育時間；背景過高時，可降低一抗濃度和縮短孵育時間。）
6． 根據用量，用稀釋液將Bio-羊抗小鼠IgG濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul Bio-羊抗小鼠IgG濃縮液混勻，此工作液4℃可保存一周)。滴加Bio-羊抗小鼠IgG工作液,20-37℃ 孵育30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗滌3次，每次2分鐘。
7．根據使用量，用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液混勻，此工作液4℃可保存一周)。滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分鐘。PBS （pH7.2-7.4）洗滌4次，每次5分鐘。
8．DAB顯色:根據用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1ml PBS加入50ul 20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B 。充分混勻后滴加到切片上。室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應。
9．蘇木素輕度復染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。 對于細胞爬片，固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5% Triton X-100室溫孵育20分鐘，PBS漂洗兩次，3% H2O2處理15分鐘；PBS漂洗兩次，接上述第4步。 對于冰凍切片，固定后，PBS漂洗兩次，接上述第二步。
注意事項：
如果染色背景過高，在SABC反應之后，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后DAB顯色。
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