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BIA Separations 150.8501-1.4 CIMac? pDNA-0.3 Analytical Column (1.4 μm)

BIA Separations 110.5118-2 CIMac PrimaS? 0.1 mL Analytical Column (2 μm)

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強大而精確的色譜分析方法是高效開發mRNA生產過程的關鍵。本文mRNA分析平臺是BIA Separations公司PATfix?分析及純化工作平臺家族的新成員PATfix? mRNA分析平臺，可實現mRNA工藝開發（PD）和生產過程中的在線監測，尤其是IVT反應成分（核苷酸和加帽試劑）以及最終產品的表征和定量，精準針對mRNA原液制備過程中的關鍵環節，為mRNA藥物的生產提供關鍵支持，幫助其加速藥物的開發。

三種方法

 下面分別介紹PATfix? mRNA分析平臺三種不同的分析方法，在PATfix? mRNA分析平臺中使用三種不同的色譜柱，支持mRNA工藝開發和最終產品的表征和定量。

方法1:使用CIMac PrimaS?進行

IVT反應監測

使用CIMac PrimaS?色譜柱（貨號：110.5118-2）和PATfix?平臺中的方法，可以實現對IVT反應成分的全面在線分析，該方法能夠定量整個IVT反應中單個核苷酸、加帽試劑和mRNA的生成（1）。該方法能夠快速優化IVT反應，對mRNA的生產、規模擴大、技術轉移或其他工藝開發活動至關重要。該方法對IVT主要成分的定量限（LOQ）是：核苷酸為6 ng，mRNA為12 ng。1中所示的兩個mRNA洗脫峰是兩種不同的mRNA異構體。

1.PrimaS色譜法分離關鍵的IVT成分PrimaS分析方法能夠對單個核苷酸進行定量，包括以單個峰洗脫的CTP和UTP。估算UTP和CTP濃度的方法利用了這兩種核苷酸在260 nm和280 nm處的紫外吸收面積之比的差異（2）。

2.CTP(1.04)和UTP(2.27)的 260/280 比值差異可用于定量PrimaS分析方法允許在線監測優化和非優化IVT條件下的反應動力學。3和4分別為通過CIMac PrimaS色譜柱分析的兩組不同IVT反應條件下mRNA產生的示例。

3.非優化IVT條件下IVT反應監測，終點mRNA濃度為1.5 mg/mL

4.在優化的IVT條件下（終點mRNA濃度為7.9 mg/mL）的IVT反應監測

方法2:使用CIMac? Oligo dT進行mRNA定量

使用CIMac? Oligo dT（目錄號：110.1219-2）和PATfix?平臺中的方法，可以進行mRNA定量。CIMac? Oligo dT是一種親和柱，將Oligo dT連接到整體柱表面，與mRNA的聚腺苷酸尾（polyA）結合。當mRNA在洗脫步驟中洗脫時，所有沒有polyA尾的其他物質（核苷酸、加帽試劑、DNA模板、酶）均在非結合條件下（流穿）洗脫。5中mRNA的LOQ值為10 ng。

5.使用Oligo dT色譜柱監測IVT樣品的色譜。未結合的物質如核苷酸、質粒、加帽試劑、酶和非聚腺苷酸化的mRNA在非結合條件下被洗脫。多腺苷酸化的mRNA在洗脫步驟中被洗脫。

使用CIMac?Oligo dT的分析方法，按照EMA和FDA的指南進行了驗證，是一種精確和快速的方法，可以對純的和復雜的樣品中的多腺苷酸化mRNA進行定量分析，精確度達到或高于90%（6）。

6.方法精確顯示，比較測量值與標稱（通過Nanodrop獲得）mRNA值。使用6條不同校準曲線的數據確定誤差線。

方法3:使用CIMac? SDVB進行

mRNA完整性表征和污染物檢測

CIMac? SDVB柱是一種反相柱，與離子配對試劑一起使用。在高溫下使用乙jing梯度分析的方法可以按大小進行分離（7），同時檢測雜質，重點是dsRNA檢測（8）。SDVB分析法對RiboRuler高范圍ssRNA進行大小分離

7.CIMac SDVB色譜柱根據Thermo Scientific? RNA High Range ladder的大小進行分離

SDVB分析法檢測dsRNA雜質在最終的mRNA產物中，最關鍵的雜質之一是dsRNA。SDVB分析法可以單次色譜分離該雜質(8)。dsRNA的分離用J2斑點免疫印跡實驗證實。

8.含有可檢測含量的dsRNA的mRNA樣品的色譜

SDVB分析法是一種穩定的檢測mRNA的方法

mRNA的完整性可以用CIMac? SDVB柱來研究，主峰的前沿可能表示mRNA的降解片段或來自IVT反應的轉錄產物。

強制降解研究（1 M NaOH，10分鐘）的mRNA藥物物質（4000 nt）導致了可觀察到的主峰前移，這是由于在主要的、完整的mRNA之前出現了一些片段。如9所示，這些較短的片段是mRNA降解的結果。