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品牌: genelb 公司: 上海晶萊生物技術有限公司

提供商： 晶萊生物 服務名稱： 蛋白質純化實驗服務 規格： 實驗服務

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實驗技術簡介：雙向電泳（two-dimensional electrophoresis）是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進行SDS-PAGE（按照分子大?。?，經染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。實驗操作流程：1、樣本制備2、固相預制膠條水化3、第一向等電聚焦（IEF）4、膠條平衡5、第二向SDS-PAGE電泳6、凝膠染色檢測7、圖片掃描實驗注意事項：客戶提供：1、原樣（組織、細胞、菌體等）濕重不少于200mg。2、蛋白提取物，濃度不少于4ug/ul，總量不少于5mg。3、寄樣須知：樣品需低溫保存，用干冰保存快遞 。交付標準：1、雙向電泳電子圖片及定量分析結果，包括差異點號碼、差異倍數。2、差異點的一級質譜或二級質譜峰圖，質譜鑒定結果，包括pI和MW等。3、雙向電泳完整的實驗步驟、使用儀器、軟件檢索參數等。一、儀器設備色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fraction collector, 需準備干凈試管約100 支）；濃縮用離心機 （低速5,000 rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 請注意其使用方法。二、藥品試劑膠體Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 預先以緩沖液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預估好膠體的使用量。b. 膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產生氣泡。c. Sephacryl 系列膠體有相當大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非專一性吸附。Buffer A-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標準分子量組合 （Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每組取0.4 mL.含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1 350）三、管柱裝填1. 以純水沖洗玻璃管柱 （以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷）；并請了解管柱的構造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，并以bufferA-150 試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行。 注意系統的擺設要適當，不要裝置于交通要沖。2. 依預估量取出Sephacryl 膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩，使的完全懸浮，但勿產生太多氣泡。3. 在管柱內加入約10 cm 高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗后膠體沈降很快。當膠體上方的液面逐漸降低時，可于頂端添加膠體，以達所要高度；膠體高度約90 cm。4. 膠體完全沈降后，小心以buffer A-150 加滿管柱，關閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。 調整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，并設定收集體積為2.5 mL/tube。5. 膠柱流洗約100 mL 后，關閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1 cm 高，注意勿破壞膠體表面平整； 然后打開出口，使液面下降至膠體面，再關閉出口，準備注入樣本。四、樣本色析進行1. 以微量移液器或滴管吸取樣本 （樣本體積不得超過膠體總體積的3%），沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面?。颖敬_實體積 _______ mL）2. 打開出口，同時開啟部分收集器；當樣本完全沒入膠體時，關閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的buffer A-150，打開出口待其慢慢進入膠體中，如此重復二次。不得擾動膠體表面，造成凹陷。3. 暫時關閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端，并把頂端端蓋鎖上；然后打開出口開始溶離，調整緩沖液瓶的高度，使流速為6 s 一滴。4. 要留心觀察前面幾個分劃，確定整個系統運轉無礙，小心部分收集器最容易出問題。管柱預計將流洗過夜，收集約80 管。

收集試管，進行蛋白質定量分析以及GUS 活性測定，并請作圖。5. 收集GUS 活性區，以Centriprep-30 濃縮至10 mL 后，加buffer A-0 稀釋至20 mL,再次濃縮至 _______ mL （GF），保留100 μL。6. 管柱請再以buffer A-150 流洗100 mL 后，小心放置一旁，準備以后進行分子量測定。

五、分子量測定1. 進行分子量測定前一天，請先以buffer A-150 流洗100 mL，并檢查膠柱內有無氣泡產生，若有嚴重的氣泡或干裂，必須重新裝填管柱。2. 取標準分子量溶液0.4 mL,加上純質目標酶0.5 mL （以親和層析法所得的AF 部份），如上法注入管柱中，立刻開始進行膠體過濾，并收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點。3. 收集所得，進行蛋白質定量分析，可定出數個蛋白質尖峰，以作為分子量依據；另以目測法，決定紅色高峰的管數，則可定出vitamin B12的溶離管數。利用以上數據，可畫出分子量與溶離管數間的直線關系，作為分子量判定的標準校正線。4. 同樣的一批分劃，請進行酶活性分析 （GUS），則可定出酶的溶離體積，對照上述標準校正線，則可求出酶的分子量。六、拆除管柱及保存膠體1. 若管柱長期不用，應當自管柱中取出膠體，以緩沖液清洗后，置冷藏室中保存，但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊，有時可能不易取出，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來。2. 膠體可以加0.01% NaN3防止霉菌生長，但使用前記得要洗去；再度使用時，請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒，若有結塊而不易打散者，也不要使用。蛋白質的分離純化方法（1）根據分子大小不同進行分離純化。蛋白質是一種大分子物質，并且不同蛋白質的分子大小不同，因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質和小分子物質分開，并使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。（2）根據溶解度不同進行分離純化。影響蛋白質溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下，不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度，根據蛋白質分子結構的特點，適當地改變外部條件，就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度，達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉淀和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。（3）根據電荷不同進行分離純化。根據蛋白質的電荷即酸堿性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。電泳是在外電場的作用下，帶電顆粒（如不處于等電點狀態的蛋白質分子）將向著與其電性相反的電極移動的現象。聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺為介質的區帶電泳，常用于分離蛋白質。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。（4）利用對配體的特異親和力進行分離純化。親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力建立起來的一種有效的純化方法。近年來，親和層析技術被廣泛應用于融合蛋白的分離純化上，因為融合蛋白具有特異性結合能力。但是在實際工作中，很難用單一方法實現蛋白質的分離純化，往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質。理想的蛋白質分離提純方法，要求產品純度和總回收率越高越好，但實際上兩者難以兼顧。隨著生物分離技術的發展、新的生物分離技術的不斷出現，為蛋白質的分離純化提供了許多新的方法和途徑。收費標準/服務周期/提供結果：歡迎咨詢詳談，我們會根據您的方案及需求制定詳細的服務協議。更多實驗技術服務請瀏覽網站其他內容，或來電咨詢！做實驗，找晶萊！您的科研生涯，我們一路相伴！【平臺項目開展范圍】慢病毒，腺病毒，RNAi類，分子生物實驗，病理實驗，免疫學實驗，細胞實驗，動物實驗，蛋白組學實驗，芯片類實驗，并為廣大客戶朋友們提供課題設計指導、基金申請指導、SCI、核心期刊等服務。全國統一咨詢服務熱線:4008-766-085【上海公司】上海市嘉定區槎溪路788弄1號17層【北京公司】北京市大興區科創十四街嘉捷·BDA企業匯16號樓三層【長沙公司】長沙市高新區麓谷大道627號新長海中心B2-403室 【技術咨詢】18500539084【公司郵箱】lab-china@genelb.cn【全國業務咨詢】北京：18810244671 上海：15800916241 長沙：15616228964 武漢：15201856307 西安：13651049420 廣州：18810244571 其他地區：13818286017【晶萊生物】已開展了數千個實驗外包項目。我們專注于醫學課題研究，已從課題申請、方案設計、試劑采購、模型構造、標本檢測、數據分析、以及對SCI撰寫與發表的支持，各個環節積累了數千個成功案例經驗，為數千個來自臨床的科研工作者解決了大量的科研問題。更多相關實驗服務信息請咨詢晶萊生物