小鼠生殖工程學(xué)技術(shù)——9CARD以外的方法凍存的精子進(jìn)行體外受精
平臺授權(quán)一級代理，咨詢微信：jinshanbio
小鼠生殖工程學(xué)技術(shù)——9CARD以外的方法凍存的精子進(jìn)行體外受精回到小鼠生殖工程學(xué)技術(shù)指南目錄
回到小鼠生殖工程凍存及培養(yǎng)試劑
◆材料
1、 用CARD以外的方法來凍存精子（凍存管或者吸管）2、 過量排卵處理后的雌性小鼠3、FERTIUP?精子孵育培養(yǎng)基（Cosmo Bio Co., Ltd）4、CARD MEDIUM?（Cosmo Bio Co., Ltd）5、mHTF6、 恒溫水箱（37°C）7、 復(fù)蘇精子用的漂浮裝置8、 剪刀9、 吸水紙10、1.5 mL EP管（微型離心管）（Quality Scientific Plastics 1.5ml Graduated Microcentrifuge Tube with Flat Top Cap, Natural Cat.No. 509-GRD-Q）11、離心分離機(jī)12、電動移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）13、培養(yǎng)皿（Corning 35mm X 10mm Cat.No.430588）14、流動石蠟（nacalai Cat.No.26137-85）15、CO2培養(yǎng)箱
◆方法
制作復(fù)蘇精子的漂浮裝置
1、50ml的離心管與泡沫組合成漂浮裝置如下圖，用于精子復(fù)蘇。
復(fù)蘇精子前的準(zhǔn)備
1、準(zhǔn)備恒溫水箱（37°C）2、用37°C的溫水裝滿漂浮裝置的離心管后，放進(jìn)水箱里，裝置就會上浮，如下圖
3、在復(fù)蘇精子前30分鐘，制作精子預(yù)孵培養(yǎng)皿（100μl FERTIUP? 精子預(yù)孵培養(yǎng)基滴液），靜置在培養(yǎng)箱里。
4、采集卵子前10分鐘，制作一個(gè)采集卵子用的培養(yǎng)皿（200μL的CARD MEDIUM?滴液），靜置在培養(yǎng)箱里。
※根據(jù)體外受精用的精子的不同，CARD MEDIUM?調(diào)試方法也不同。具體請參考操作說明書。
5、制作清洗卵子用的培養(yǎng)皿（80μLmHTF滴液4個(gè)），在培養(yǎng)箱里靜置30分鐘以上。
未受精卵的采集和培養(yǎng)
1、讓進(jìn)行了過量排卵處理的雌性小鼠在注射了hCG 的15~17個(gè)小時(shí)后安樂死，然后把卵子塊放進(jìn)采集卵子用的培養(yǎng)皿的CARD MEDIUM?滴液里（一滴液里可放3~10只雌性小鼠的卵子塊）。
※ 從雌性小鼠安樂死后到將輸卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM?滴液這一過程要在極短時(shí)間內(nèi)完成（30秒內(nèi)）。
※一個(gè)人實(shí)驗(yàn)的情況下，請不要一次性安樂死數(shù)只雌性小鼠，應(yīng)該一只只地進(jìn)行，并迅速采集卵子。2、未受精卵在采集卵子培養(yǎng)皿里預(yù)孵培養(yǎng)60分鐘。
解凍精子
1、從液氮儲存器中取出樣品（放有凍結(jié)精子的試管或吸管），迅速放置37°C恒溫水箱里。精子在凍存管的情況下，要迅速打開管蓋，倒掉管內(nèi)的液氮，然后浸泡在恒溫水箱內(nèi)。精子在吸管的情況下，要迅速將吸管放置恒溫水箱的漂浮裝置里。
2、把樣品內(nèi)的所有精子懸濁液移置到1.5ml的EP管內(nèi)，慢慢加入37°C的mHTF （1.2mL），輕輕攪拌后進(jìn)行離心（300g 5分鐘 室溫）；
3、去除澄清層（mHTF 里含有約30μL的顆粒會沉淀在試管底部）。然后加入37°C的FERTIUP?精子預(yù)孵培養(yǎng)基70μL，輕輕搖勻）
4、用槍頭吸取EP管內(nèi)的全部液體，注射進(jìn)精子預(yù)孵培養(yǎng)皿的滴液里，進(jìn)行30分鐘的預(yù)孵培養(yǎng)。
受精
1、用槍頭吸取預(yù)孵后的未受精卵時(shí)，盡量少吸入培養(yǎng)液，然后把未受精卵注射到含有復(fù)蘇精子的精子預(yù)孵培養(yǎng)皿的滴里，進(jìn)行受精。
2、受精3小時(shí)后，在清洗卵子培養(yǎng)皿的mHTF滴液里清洗正常形態(tài)的卵子，培養(yǎng)至次日。
3、受精6個(gè)小時(shí)后，仔細(xì)觀察卵子，去取單性生殖卵（卵子細(xì)胞內(nèi)只有1個(gè)原核），其余卵子培養(yǎng)至次日。4、次日，只把發(fā)育到2細(xì)胞期的胚胎移到清洗卵子用的培養(yǎng)皿內(nèi)留下的滴液里，數(shù)完胚胎數(shù)后，就能將其用于移植或者凍存。
參考文獻(xiàn)
[1] Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Takeshita Y., Nakamuta Y., Umeno T., and Tsuchiyama
S. 2014. RescueIn VitroFertilization Method for Legacy Stock of Frozen Mouse Sperm.J Reprod Dev.?60(2): 168-171
授權(quán)一級代理請認(rèn)準(zhǔn)金山科研平臺，產(chǎn)品價(jià)格和貨期請咨詢微信：jinshanbio ，詢價(jià)請加微信：jinshanbio
? 如需詢價(jià)，請加客服QQ：1749072012 、客服微信：jinshanbio，或發(fā)送郵件到1749072012@qq.com
? 平臺為生命科學(xué)研究相關(guān)領(lǐng)域提供一站式耗材試劑儀器解決方案和采購服務(wù)，數(shù)據(jù)資源基于CC協(xié)議。
? 本文地址：http://www.yeybxjkgt.cn/thread-59310.htm
特別聲明：以上內(nèi)容(如有圖片亦包括在內(nèi))來源于授權(quán)廠家或網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請聯(lián)系客服刪除，本平臺不提供信息校正和存儲服務(wù)。
Notice: The content above (including the pictures if any)comes from authorized manufacturers or networks. In case of infringement, please contact to delete it. This platform does not provide information storage services.
QQ:1749072012