小鼠生殖工程學技術——5凍存運輸小鼠２細胞期胚胎
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◆材料
1. 2細胞期胚胎（新鮮或凍融復蘇后的胚胎）
2. 培養皿（coring 35mm X 10mm Cat.No.430588）
3. 電動移液器（GILSON PIPETMAN P-200）
4. M２ Medium (Sigma Cat.No.M7167)
5. 0.5 mL EP管（Fisherbrand Flip Cap Microtubes 0.5 mL, Fisher Scientific Cat.No. FS-MCT-060-C）
6. 微管
7. KSOM/AA
8. 流動石蠟（Nacalai Tesque Cat.No.26137-85）
9. 紐扣式溫度記錄儀（KN Laboratories temperature data logger Samokuron G type）
10. CARD 冷藏運輸試劑盒
o 紙盒（free-s1 Cat.No. 11-1585）
o 棉布
o 保溫瓶（Thermos Co., Ltd. Cat.No.JMK-501）
o 冰袋（小）（Kyoritsu Co., Ltd. 冰袋霧凇 Cat.No. H-120）
o 冰袋（大）（shiro產業 冰袋R 500g 140 mm×250 mm、Cat.No. M250R-50）
o 泡沫箱（KARUX KC-3）
◆步驟
2細胞期胚胎的凍存
１. 用移液器（P-200）在培養皿上制作兩個１００μL M２的滴液（不要被流動石蠟覆蓋）。 ２. 把凍存的胚胎從被流動石蠟覆蓋著的培養液里移至到一個M2滴液里。
３. 更換新的微管，將胚胎從一個M2滴液移至另一個M2滴液里。
＊把從被流動石蠟覆蓋的培養液滴液移至制作好的M2滴液里的胚胎移至到另一個M2的滴液時，盡量避開附著流動石蠟的滴液位置。
４. 往０.５mL EP管內加入０.６mL的M２。
＊如果EP管頂部留有氣泡時，需輕拍出氣泡。
５. 從3個滴液里取出胚胎后放置在裝滿０.６mL的M２０.５mL EP管底部（一只EP管能放40個2細胞期胚胎）。
＊ 移動胚胎后，在3個滴液里移液，確認微管里是否殘留胚胎。
６. 合上EP管蓋子，并用封口膜包封。 ７. 在紙盒里裝入EP管、紐扣式溫度記錄儀和棉布后，蓋上盒蓋紙箱。 M２、紙盒、EP管、紐扣式溫度記錄儀和棉布全在室溫（20～25°C）下使用。
８. 紙盒保存在冷凍柜里（最長可保存72小時）。
2細胞期胚胎的冷藏運輸
與上述凍存步驟一樣，把EP管放進紙盒（2細胞期胚胎的凍存1~7步）后，按以下操作包裝紙盒。
樣品是常溫的情況只需用保溫瓶和小冰袋，4~8°C凍存的樣品，則需要使用泡沫箱及大冰袋，包裝時動作要迅速。
１. 把紙盒放進保溫瓶內。
２. 再放進兩個小冰袋至保溫瓶內。
３. 緊緊蓋上保溫瓶蓋。
４. 確認瓶蓋蓋緊后，在泡沫箱內鋪上大冰袋，然后放入保溫瓶（這時，請注意請勿倒放保溫瓶里裝有胚胎的EP管）。接著，保溫瓶兩側也放上大冰袋。最后用包裝帶固牢泡沫箱蓋。
５. 用快遞運送，整個泡沫箱保存在（４～８°C）冷凍柜里。
６. 用快遞凍存運輸最長保存時間可達72小時。
＊冬季的室外氣溫會低至０°C以下，如果運輸過程中泡沫箱長時間放置在室外，2細胞期胚胎就會死亡。寄方應首先聯系附近的快遞配送站，跟他們強調泡沫箱內放有活細胞，請注意切勿放置在室外。
更改 : 2013.03.06 放有2細胞期胚胎的紙盒與冰袋放進保溫瓶的順序互換，因為先放冰袋后放紙盒，使紙盒難以受到內外氣溫差的影響，原頁面請點擊此處。
從冷藏運輸試劑盒里取出2期細胞胚胎
1. 注入3滴100μL 的KSOM/AA在培養皿上，然后用流動石蠟覆蓋。把培養皿放入培養箱里孵育至少30分鐘。
2. 從保溫瓶里取出放有樣品的紙盒。
3. 紙盒在室溫下放置30分鐘。
注意:胚胎將在30分鐘內沉在EP管底部。
4. 打開紙盒，輕輕地取出棉花，一旦取出棉花后，要拿起裝有胚胎的EP管，并打開蓋子。
5. 用灌注凝膠槍頭收集EP管中M2上清液200μL，然后轉移到培養皿的邊緣。
6. 用灌注凝膠槍頭小心地把全部M2包括在EP管底部的胚胎移至培養皿的中心。 注意:為了方便操作，在使用移液器時盡量避免吸入空氣。
7. 從M2里采集的胚胎，分別轉移至3個100μL KSOM/AA 滴液中，進行清洗。
注意:如果不能移走所有的胚胎，可以用培養皿邊緣上的200μL M2滴液來清洗EP管內部。
8. 然后把胚胎移植到代孕小鼠的輸卵管內。
注意: 理論上，在胚胎清洗完至移植到代孕小鼠體內的這一過程需在短時間內完成。 (請參考“胚胎移植入輸卵管”)
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